La fermentación ruminal in vitro es una técnica clave para evaluar el valor nutricional de los alimentos o ingredientes para rumiantes, sin embargo, su precisión depende en gran medida del líquido ruminal utilizado. Para minimizar las discrepancias que surgen de los diferentes líquidos ruminales, mejorar las técnicas de conservación para mantener una calidad constante del líquido ruminal es una estrategia prometedora. Aunque gran parte de la investigación existente se ha centrado en la conservación del líquido ruminal, la aplicación real de esta técnica implica un inoculo mixto, que es una combinación de líquido ruminal y medio de cultivo artificial. Este estudio tuvo como objetivo investigar cómo los diferentes tiempos de almacenamiento del inoculo mixto afectan las características de fermentación ruminal in vitro y la composición de la comunidad microbiana. Nuestros hallazgos revelaron variaciones entre el inoculo mixto almacenado a las 0 h y aquellos almacenados durante 12, 24, 36 y 48 h, con diferencias particularmente notables a las 24 h y 48 h. Basado en estos resultados, se recomienda utilizar un inoculo mixto almacenado dentro de las 24 h para pruebas de fermentación ruminal in vitro. Este estudio monitoreó los cambios dinámicos en las características de fermentación ruminal y las comunidades microbianas a través de varios tiempos de almacenamiento del inoculo mixto, proporcionando valiosos conocimientos para refinar el control de variables en las técnicas de fermentación ruminal in vitro.