La tolerancia al calor es importante para la producción sostenible de muchos cultivos, incluido el chile. La tolerancia a altas temperaturas es compleja e implica varios rasgos, siendo la viabilidad del polen uno de los más importantes. Los ensayos de polen in vitro para la tolerancia al calor se han utilizado ampliamente en el chile; sin embargo, las asociaciones entre el tratamiento del polen y la polinización no han sido ampliamente exploradas. Los objetivos de este estudio fueron validar la utilidad de la caracterización del polen sometido a estrés por calor in vitro a través de la polinización in vivo durante las temporadas de verano e invierno, y evaluar la compatibilidad cruzada entre especies silvestres y domesticadas para iniciar el desarrollo de poblaciones de introgresión. Se utilizaron siete entradas de especies silvestres y domesticadas cultivadas durante las temporadas de verano e invierno para evaluar la tasa de éxito de la polinización. El polen se utilizó directamente o se trató a 38 grados Celsius durante cuatro horas antes de realizar la autopolinización y la polinización cruzada entre todas las entradas. Se identificaron asociaciones significativas entre el tratamiento del polen in vitro y la tasa de éxito de la polinización durante las temporadas de verano e invierno. El tratamiento de calor fue un contribuyente mayor a la variabilidad que el entorno de crecimiento, lo que valida informes previos sobre la utilidad de estudiar el polen in vitro en la selección para la tolerancia al calor. Se identificaron los accesos del progenitor silvestre var. PBC 1969 y PBC 1970, como una fuente potencialmente tolerante al calor para su uso en la cría e investigaciones futuras. Este trabajo proporciona una base para futuras investigaciones en la exploración de componentes adicionales de tolerancia al calor, así como para el desarrollo de ensayos de fenotipado para el polen u otros rasgos florales.