El potencial inhibitorio de las plantas alelopáticas es objeto de una creciente atención en la investigación por su aplicación en el manejo de malezas. La hoja de caña de azúcar es un producto de desecho agrícola que se ha informado que tiene potencial alelopático. Por lo tanto, el presente estudio determinó el sistema de disolvente orgánico óptimo y el procedimiento de fraccionamiento para mejorar la cantidad de este extracto y su eficiencia alelopática. Las hojas de caña de azúcar se extrajeron utilizando cinco proporciones de disolvente etanol/agua: 00:100, 25:75, 50:50, 75:25 y 100:00. Sus efectos alelopáticos sobre la germinación de semillas y el crecimiento de plántulas se evaluaron en dos malezas principales. Los resultados mostraron que la concentración del extracto, la proporción del disolvente y su interacción inhibieron significativamente los parámetros de crecimiento. En consecuencia, se utilizó una proporción cruda de etanol/agua de 00:100 para separar la fracción activa mediante partición de disolventes ácidos y básicos. La fracción ácida (AE) ejerció el mayor efecto inhibitorio e inhibió completamente (100%) en todas las concentraciones, seguida de la fracción cruda original, la fracción neutra y la fracción acuosa. Además, todas las fracciones tuvieron efectos selectivos, inhibiendo mucho más que en las pruebas de laboratorio. El análisis químico mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas indicó que la fracción AE contenía 20 compuestos diferentes. Los cinco compuestos principales incluían alcaloides, ácidos orgánicos y fenoles. Por lo tanto, se seleccionó la fracción AE para su formulación en una suspensión concentrada y se probó por sus características herbicidas. La formulación mostró actividades tempranas post-emergencia y tuvo un efecto más fuerte en comparación con otras. El mecanismo fisiológico de la formulación se probó contra otras. Las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico y el HO ocurrieron en la hoja, lo que sugiere peroxidación lipídica y disrupción celular.