El colágeno, como proteína estructural, está ampliamente distribuido en el cuerpo humano. Muchos factores influyen en la autoensamblaje del colágeno in vitro, incluyendo condiciones físico-químicas y el microentorno mecánico, y juegan un papel clave en la estructura y disposición. Sin embargo, el mecanismo exacto es desconocido. El propósito de este artículo es investigar los cambios en la estructura y morfología del autoensamblaje del colágeno in vitro bajo un microentorno mecánico, así como el papel crítico del ácido hialurónico en este proceso. Utilizando colágeno bovino tipo I como objeto de investigación, se carga la solución de colágeno en dispositivos de tensión y gradiente de esfuerzo-deformación. La morfología y distribución del colágeno se observa utilizando un microscopio de fuerza atómica mientras se cambia la concentración de la solución de colágeno, la fuerza de carga mecánica, la velocidad de tensión y la relación de colágeno a ácido hialurónico. Los resultados demuestran que el campo mecánico gobierna las fibras de colágeno y cambia su orientación. El estrés magnifica las diferencias en los resultados causadas por diferentes concentraciones y tamaños de estrés, y el ácido hialurónico mejora la orientación de las fibras de colágeno. Esta investigación es crítica para expandir el uso de biomateriales a base de colágeno en la ingeniería de tejidos.