Se ha reconocido ampliamente que la aplicación de fertilizantes orgánicos (OF) en monocultivos y cultivos continuos puede cambiar la comunidad microbiana y aumentar la biomasa forrajera en el altiplano Qinghai-Tíbet. Sin embargo, como patrón de siembra de pastizales comúnmente utilizado, aún no está claro cómo responden las mezclas de pasto-leguminosa a la aplicación de OF. Para aclarar los efectos de la aplicación de fertilizantes orgánicos en las mezclas de pasto-leguminosa, realizamos un experimento de campo en el altiplano Qinghai-Tíbet y recolectamos suelos rizosféricos y a granel para revelar su comunidad microbiana utilizando secuenciación de alto rendimiento y redes ecológicas moleculares. Se encontró que la aplicación de OF cambió la comunidad microbiana y aumentó la biomasa forrajera en monocultivos. Sin embargo, en las mezclas de pasto-leguminosa, encontramos que la aplicación de OF no promovió el aumento de la biomasa forrajera (Gramineae) (Prueba t de Student: > 0.05). Al analizar las comunidades de procariotas y hongos, se encontró que la aplicación de OF tuvo un mayor impacto en los microorganismos del suelo a granel que en los de la rizosfera en las mezclas de pasto-leguminosa. El análisis de la red de co-ocurrencia mostró que las redes de rizosfera y suelo a granel de las mezclas de pasto-leguminosa fueron significativamente más vulnerables bajo tratamiento de OF (vulnerabilidad de procariotas en pasto: 0.1222; vulnerabilidad de procariotas en leguminosas: 0.1730; vulnerabilidad fúngica en pasto: 0.0116; vulnerabilidad fúngica en leguminosas: 0.0223) que bajo tratamiento sin OF (vulnerabilidad de procariotas en pasto: 0.1015; vulnerabilidad de procariotas en leguminosas: 0.1337; vulnerabilidad fúngica en pasto: 0.0046; vulnerabilidad fúngica en leguminosas: 0.0126), lo que indicó que la aplicación de OF no proporcionó condiciones favorables para las interacciones microbianas en las mezclas de pasto-leguminosa. Además, el modelado de ecuaciones estructurales mostró que la aplicación de OF tuvo algunos impactos negativos significativos en las propiedades fisicoquímicas del suelo y la robustez de la comunidad procariota. La robustez de los hongos tuvo un impacto negativo significativo ( < 0.001) en la biomasa forrajera, pero la aplicación de OF no tuvo un impacto directo significativo ( > 0.05) en la biomasa forrajera, lo que indicó que el OF no promovió la biomasa forrajera en las mezclas de pasto-leguminosa. Estos resultados sugieren que la aplicación de fertilizantes orgánicos es innecesaria para las mezclas de pasto-leguminosa, ya que no promueve las interacciones entre los microbios rizosféricos y el forraje.