Este estudio investiga los efectos de la composición del sustrato en la arquitectura de la raíz, el crecimiento de la planta y los metabolitos secundarios alelopáticos, específicamente benzoxazinoides (BX), en las rizosferas de centeno (Secale cereale L.) y amaranto (Amaranthus retroflexus L.). Dadas las complejidades del análisis de exudados de raíces, incluyendo la influencia del sustrato en la morfología de la raíz y la exudación, el experimento comparó el crecimiento de las plantas y la liberación de BX en dos sustratos: microperlas de vidrio y una mezcla de perlas de arcilla y atapulgita. El centeno, el amaranto y las co-culturas de ambos se cultivaron en condiciones controladas, con parámetros de raíz y brote medidos para evaluar la idoneidad del sustrato. Además, se utilizó UPLC-QTOF-MS para analizar los BX en el centeno y las co-culturas de centeno-amaranto. Los resultados demostraron que la mezcla de perlas de arcilla y atapulgita proporcionaba mejores condiciones de crecimiento y era efectiva para la extracción de BX, lo que la convierte en un sustrato adecuado para estudiar la alelopatía en entornos controlados. Los hallazgos resaltan el papel crítico de la composición del sustrato tanto en el desarrollo de la planta como en el estudio de los exudados de raíces, con implicaciones para una mejor comprensión de las interacciones cultivo-maleza y la alelopatía.