El modelo celular porcino de edición de múltiples genes puede analizar los mecanismos genéticos de múltiples genes, lo que es beneficioso para acelerar la cría genética. Sin embargo, ha habido una falta de una estrategia efectiva para realizar simultáneamente una edición precisa de múltiples genes en células porcinas. En este estudio, nuestro objetivo fue mejorar la eficiencia de la edición genética precisa mediada por CRISPR RNP en células porcinas. Se utilizó CRISPR RNP, que incluye la proteína Cas9, sgRNA y ssODN, para generar sustituciones nucleotídicas precisas mediante reparación dirigida por homología (HDR) en fibroblastos fetales porcinos (PFFs). Estos componentes se introdujeron en PFFs mediante electroporación, seguido de PCR para cada sitio objetivo. Para mejorar la eficacia de HDR, se emplearon el pequeño molécula M3814 y ssODN modificados con fosforotioato. Todas las muestras de ADN objetivo fueron secuenciadas y analizadas, y se compararon las eficiencias de diferentes combinaciones del sistema CRISPR RNP en los sitios objetivo. Los resultados mostraron que cuando se utilizó 2 M M3814, una pequeña molécula que inhibe la reparación mediada por NHEJ al bloquear la actividad de DNA-PKs, no hubo toxicidad para los PFFs. La eficiencia de HDR mediada por CRISPR RNP aumentó 3.62 veces. La combinación de CRISPR RNP con 2 M M3814 y PS-ssODNs logró una eficiencia de modificación genética precisa mediada por HDR de aproximadamente 42.81% en células mutadas, un aumento de 6.38 veces en comparación con el grupo de control. Luego, utilizamos el sistema CRISPR RNP optimizado para realizar la edición simultánea de dos y tres loci en los genes. Los resultados mostraron que el sistema CRISPR RNP podía editar simultáneamente dos y tres loci. La eficiencia de la edición simultánea de dos loci no fue significativamente diferente de la de la edición de un solo gen en comparación con la eficiencia de la edición de un solo locus. La eficiencia de la edición precisa simultánea de , exon 1 y exon 2 fue de 0.29%, 0.24% y 1.05%, respectivamente. Este estudio demostró que una combinación de 2 M M3814 con PS-ssODNs mejora la eficacia de la edición genética precisa mediada por CRISPR RNP y permite la edición precisa de hasta tres genes simultáneamente en células porcinas.