Hasta hace poco, el método preferido para hacer modificaciones dirigidas en el genoma de la levadura en crecimiento implicaba la introducción de una plantilla de ADN que llevaba los cambios genéticos deseados junto con un marcador seleccionable, flanqueado por brazos de homología. Este enfoque limitaba la capacidad de hacer cambios dentro de los genes debido a la interrupción por el marcador seleccionable introducido y evitaba el uso de ese marcador seleccionable para manipulaciones genómicas posteriores. Tras el descubrimiento de la edición del genoma mediada por CRISPR-Cas9, se desarrollaron protocolos para modificar cualquier región de interés del ADN en un paso de transformación único similar sin necesidad de un marcador seleccionable permanente. Este enfoque implica la generación de una rotura de doble cadena de ADN (DSB) en la ubicación genómica deseada por la nucleasa Cas9, expresada en un plásmido que también expresa la secuencia de ARN guía (gRNA) que dirige la ubicación de la DSB. La DSB se repara posteriormente mediante recombinación homóloga utilizando una plantilla de reparación de ADN derivada de PCR. Aquí, describimos en detalle un método mejorado para la incorporación de las secuencias de ADN que codifican el gRNA en el plásmido de expresión de Cas9. Utilizando la clonación Golden Gate, los oligonucleótidos apareados que llevan salientes de ADN de cadena única únicos se unen en sitios direccionales de enzimas de restricción. Describimos el uso de este protocolo de edición del genoma CRISPR-Cas9 para introducir múltiples tipos de cambios genéticos dirigidos en el genoma de la levadura.