El tomate (L.), uno de los cultivos hortícolas más consumidos en todo el mundo, también es una fuente notable de alérgenos alimentarios, con una mayor prevalencia de reacciones alérgicas en pacientes sensibilizados al polen. La profilina, una pequeña proteína que se une a la actina, es un alérgeno principal en los frutos de tomate codificado por dos genes homólogos. Aunque se han propuesto diversas estrategias para reducir la alergenicidad en los alimentos, ningún estudio previo ha logrado la eliminación completa de las proteínas de profilina en el tomate utilizando edición genética precisa. En este estudio, diseñamos un ARN guía único que apunta a una región conservada de ambos genes y empleamos el sistema CRISPR/Cas9 para generar mutaciones de pérdida de función. Primero evaluamos la eficiencia de edición del ARN guía único en protoplastos de tomate y luego realizamos una transformación estable mediada por - que dio lugar a 13 líneas transgénicas T. Los análisis de genotipado y Western blot confirmaron la edición exitosa en ambos loci objetivo y una disminución significativa de la acumulación de profilina en los frutos de tomate mutantes. Notablemente, se identificaron dos líneas homocigotas libres de Cas9 en la generación T1, y una de estas (línea 23-15) mostró niveles significativamente reducidos de proteína de profilina en el fruto. Estos hallazgos demuestran que la interrupción mediada por CRISPR/Cas9 de los genes alergénicos elimina efectivamente la profilina de los frutos de tomate. Esta estrategia proporciona un marco prometedor para desarrollar cultivares de tomate hipoalergénicos que pueden extenderse a otras especies de cultivos relacionadas.