Los ADN-zimas han atraído un interés creciente en el desarrollo de herramientas genéticas, terapias y biosensores. Entre ellos, los G-cuádruplexes se utilizan ampliamente como los elementos estructurales clave de los ADN-zimas para activar la competencia catalítica de cofactores específicos, como la hemina, pero existe una gran demanda de diversificar los ADN-zimas utilizando otras estructuras de ADN más sencillas, como el dúplex completamente emparejado (FM-DNA). Sin embargo, los pares de bases perfectos en el dúplex limitan la actividad del ADN-zima. En este trabajo, se desarrolló un ADN-zima fotocatalítico al introducir un sitio abásico (sitio AP) en el dúplex (AP-DNA) para cambiar su actividad fotocatalítica. La palmatina (PAL), un fotosensibilizador de alcaloides isoquinolínicos naturales, sirvió como cofactor del ADN-zima al unirse en el sitio AP. El sitio AP proporciona un entorno menos polarizado para favorecer la fluorescencia de la PAL. Como resultado, el oxígeno disuelto se convirtió en oxígeno singlete (O) a través de la transferencia de energía de la PAL excitada. La oxidación de sustratos por el O fotogenerado in situ sirvió como una lectura para el ADN-zima. Además, el ADN-zima basado en dúplex fue diseñado a partir de FM-DNA mediante la uracilo-DNA glicosilasa en cascada para generar AP-DNA. Nuestro trabajo proporciona una nueva forma de construir ADN-zimas basados en dúplex.