Se han establecido protocolos de criopreservación de espermatozoides para el pez gato amarillo, pero la criopreservación aún puede causar daño celular y afectar la viabilidad y fertilidad de los espermatozoides. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de añadir o no añadir crioprotectores durante el almacenamiento a baja temperatura sobre el daño ultrastructural, el daño oxidativo y el daño en el ADN de los espermatozoides de pez gato amarillo descongelados. El semen mezclado de tres machos de pez gato amarillo se dividió en un grupo de espermatozoides frescos, un grupo de espermatozoides congelados (DMSO) con un crioprotector (10% DMSO) y un grupo de espermatozoides congelados sin un crioprotector (DMSO). Se observaron los ultrastructurales de los espermatozoides después de la descongelación bajo un microscopio electrónico y se evaluaron los espermatozoides para las actividades enzimáticas de SOD, MDA y T-AOC, así como para la integridad del ADN. En términos de parámetros de movimiento, en comparación con DMSO, la adición de DMSO mejoró significativamente la motilidad espermática, la velocidad de la línea curva (VCL) y la velocidad de la línea recta (VSL). Los resultados ultrastructurales mostraron que, aunque los espermatozoides descongelados exhibieron un daño mayor que los espermatozoides frescos, el 10% de DMSO redujo efectivamente el daño a la membrana plasmática, las mitocondrias y el flagelo de los espermatozoides por criopreservación, y la mayoría de los espermatozoides se conservaron con una estructura intacta. Los resultados del daño oxidativo mostraron que, en comparación con los espermatozoides congelados, el 10% de DMSO aumentó significativamente las actividades de las enzimas SOD y T-AOC y redujo claramente la actividad de la enzima MDA. La capacidad antioxidante de los espermatozoides mejoró, la peroxidación lipídica se redujo y el daño oxidativo causado por la criopreservación se mitigó. La integridad del ADN de los espermatozoides mostró que el 10% de DMSO redujo claramente la tasa de fragmentación del ADN. En conclusión, el 10% de DMSO puede reducir efectivamente el daño ultrastructural, el daño oxidativo y el daño en el ADN de los espermatozoides de pez gato amarillo durante la criopreservación; también puede optimizar aún más el protocolo de criopreservación para los espermatozoides de pez gato amarillo. Mientras tanto, también proporciona una base teórica para la futura optimización de los protocolos de criopreservación.