La lechuga es un vegetal de hoja de importancia global, valorado tanto por sus contribuciones económicas como nutricionales. La conservación y uso eficiente del germoplasma de lechuga son cruciales para la mejora genética y el cruce. Este estudio examinó la diversidad genética y la estructura poblacional de una colección central del germoplasma de lechuga utilizando genotipificación por secuenciación (GBS). Se identificaron un total de 7136 polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) de alta calidad en nueve cromosomas. El análisis poblacional a través de agrupamiento bayesiano y análisis discriminante de componentes principales (DAPC) reveló tres clústeres genéticos distintos. El clúster 2 mostró la mayor diversidad genética, mientras que el clúster 3 tuvo altos niveles de endogamia. La evaluación de rasgos agromorfológicos identificó además diferencias significativas en la longitud de las hojas, el peso de la planta y la altura de la cabeza entre los clústeres. Estos hallazgos proporcionan valiosos conocimientos sobre la diversidad genética y fenotípica de la lechuga, facilitando el desarrollo de programas de cría más robustos. Además, la colección central establecida en este estudio ofrece un subconjunto representativo del germoplasma de lechuga para futuras investigaciones genómicas y esfuerzos de conservación.