El grupo Incertae sedis, dentro de la familia Characidae, actualmente comprende 88 géneros, anteriormente incluidos en la subfamilia Tetragonopterinae. Entre ellos se encuentra el género Astyanax, que comprende un grupo de especies con morfología similar y una amplia distribución en el Neotrópico. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo analizar la diversidad cariotípica de las especies de Astyanax de diferentes cuencas hidrográficas mediante tinción convencional de Giemsa, bandas C y sonda de hibridación in situ fluorescente (FISH rDNA 18S). Se utilizaron especímenes de Astyanax aff. paranae pertenecientes al complejo scabripinnis, Astyanax asunsionensis y Astyanax aff. Se analizaron dos cariomorfos simpátricos en Astyanax. aff. paranae, uno con 2n = 48 y el otro con 2n = 50 cromosomas. Otra población de esta misma especie también presentó 2n = 50 cromosomas, pero difirió en la fórmula del cariotipo y con cromosomas supernumerarios macroscópicos presentes en el 100 % de las células en aproximadamente el 80 % de las hembras analizadas. Dos poblaciones de A. asuncionensis y una población de Astyanax. aff. bimaculatus también mostraron un número diploide de 50 cromosomas, pero también difirieron en sus fórmulas del cariotipo. Por lo tanto, A. asuncionensis también se caracterizó por su diversidad cromosómica intraespecífica. El análisis de bandas C demostró un patrón distintivo de heterocromatina, que diferencia a A. asuncionensis de Astyanax aff. paranae y Astyanax aff. bimaculatus. El cromosoma supernumerario de Astyanax aff. paranae resultó completamente heterocromático. Solo Astyanax aff. bimaculatus mostró múltiples sitios de regiones organizadoras nucleolares. Las demás especies se caracterizaron por tener un sistema simple de NOR. Estos datos contribuyen al conocimiento de la biodiversidad existente en nuestra ictiofauna, destacada aquí por la diversidad cromosómica interespecífica e intraespecífica en el género Astyanax.