La gestión reproductiva eficiente de las vacas lecheras depende principalmente de la identificación precisa del estro. Sin embargo, los métodos de detección de estro actualmente disponibles, como la observación visual, son deficientes. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de descubrir nuevos biomarcadores en fluidos corporales no invasivos, como la leche, para detectar de manera confiable el estado de estro. La proteómica es una herramienta emergente y prometedora para identificar biomarcadores. En este estudio, se realizó un enfoque proteómico en leche muestreada de vacas lecheras en estro y no en estro para identificar posibles biomarcadores de estro. Las vacas lecheras fueron sincronizadas y programadas para la inseminación artificial, y las vacas con inseminación que llevó a la concepción se consideraron en estro el día de la inseminación (día 0). Se recolectaron muestras de leche del día 0 (grupo de estro) y del día -3 (grupo de no estro) de vacas lecheras confirmadas como embarazadas para análisis proteómico utilizando el enfoque de etiquetas de masa en tándem (TMT). Se identificaron un total de 89 proteínas expresadas diferencialmente, de las cuales 33 estaban reguladas al alza y 56 estaban reguladas a la baja en la leche de estro en comparación con la leche de no estro. El análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) mostró que la acetil coenzima A carboxilasa alfa (ACACA), la apolipoproteína B (APOB), la deshidrogenasa esteroide similar a NAD(P)H (NSDHL), la perilipina 2 (PLIN2) y la paraoxonasa 1 (PON1) participaron en la unión de lípidos, almacenamiento de lípidos, localización de lípidos y proceso metabólico de lípidos, así como en la unión de ácidos grasos, biosíntesis de ácidos grasos y metabolismo de ácidos grasos, y estos procesos están bien documentados como relacionados con la regulación del estro. Se proponen estas proteínas de la leche como posibles biomarcadores de estro en vacas lecheras. Se requieren estudios de validación adicionales en una población grande para determinar su potencial como biomarcadores de estro.