La investigación de células madre/microambientales multipotentes (MSCs) in vitro representa una base importante para estudios traslacionales en modelos de animales grandes. El objetivo del estudio fue examinar y comparar las propiedades in vitro clínicamente relevantes de las MSCs equinas, que fueron aisladas de tejido adiposo abdominal (abd), retrobulbar (rb) y subcutáneo (sc) mediante digestión con colagenasa (ASCs-) y una técnica de explante (ASCs-). En primer lugar, examinamos la proliferación y la diferenciación trilineal y, en segundo lugar, el potencial de diferenciación cardiomiogénica utilizando activina A, proteína morfogenética ósea-4 y Dickkopf-1. Se obtuvieron ASCs- similares a fibroblastos y adherentes al plástico de todas las fuentes. El potencial de proliferación y diferenciación condrogénica no difirió significativamente entre los métodos de aislamiento y las localizaciones. Sin embargo, los abd-ASCs- mostraron el mayor potencial de diferenciación adipogénica en comparación con los rb- y sc-ASCs- en el día 7 y los abd-ASCs- un mayor potencial adipogénico en comparación con los abd-ASCs- en el día 14. El potencial de diferenciación osteogénica fue comparable en el día 14, pero para el día 21, los abd-ASCs- demostraron un mayor potencial osteogénico en comparación con los abd-ASCs- y rb-ASCs-. No se pudo lograr la diferenciación cardiomiogénica. Este estudio proporciona información sobre el potencial de proliferación y diferenciación multinivel de los ASCs equinos y se espera que proporcione una base para futuros estudios preclínicos y clínicos en caballos.