En este estudio, se observaron cambios en el rendimiento de la leche, la digestibilidad de nutrientes, los parámetros de fermentación del intestino posterior y la microflora al inducir la depresión de grasa en la leche (DGL) en vacas lecheras alimentadas con una dieta alta en almidón o alta en grasa. Ocho vacas Holstein fueron emparejadas en un diseño cruzado completamente aleatorizado dentro de dos períodos de 35 días (18 días de período de control y 17 días de período de inducción). Durante el período de control, todas las vacas fueron alimentadas con una dieta baja en almidón y baja en grasa (CON), y en el período de inducción, cuatro de las vacas fueron alimentadas con una dieta alta en almidón con trigo triturado (IS), y las otras vacas fueron alimentadas con una dieta alta en grasa con grasa de girasol (IO). Los resultados mostraron que, en comparación con cuando las vacas fueron alimentadas con la dieta CON, cuando las vacas fueron alimentadas con la dieta IS o IO, tuvieron menores concentraciones de grasa en la leche, leche corregida por energía, rendimiento de leche corregido por 3.5% de grasa, eficiencia alimentaria y digestibilidad aparente de NDF y ADF. Sin embargo, las vacas alimentadas con la dieta IO tuvieron una menor digestibilidad aparente de extractos etéreos. Además, observamos que cuando las vacas fueron alimentadas con la dieta alta en almidón (IS) o alta en grasa (IO), tuvieron una mayor concentración fecal de propionato y acetato, y un menor NH-N. En comparación con cuando las vacas fueron alimentadas con la dieta CON, las vacas alimentadas con la dieta IS tuvieron un pH más bajo, y las vacas alimentadas con la dieta IO tuvieron una menor concentración de valerato en las heces. En la microbiota del intestino posterior, la abundancia relativa de Oscillospiraceae_UCG-005 aumentó, mientras que la Verrucomicrobiota y el grupo Lachnospiraceae_AC2044 disminuyeron cuando las vacas fueron alimentadas con la dieta IO. La abundancia relativa de Prevotellaceae_UCG-003 aumentó, mientras que Alistipes y Verrucomicrobiota disminuyeron, y Treponema, Spirochaetota y el grupo Lachnospiraceae_AC2044 mostraron una tendencia a la disminución cuando las vacas fueron alimentadas con la dieta IS. En resumen, este estudio sugiere que la alimentación alta en almidón o alta en grasa podría inducir DGL en vacas lecheras, y la dieta alta en grasa tuvo el mayor efecto en la grasa de la leche; la dieta alta en almidón o alta en grasa afectó la fermentación del intestino posterior y la digestibilidad aparente de la fibra. Los cambios en la flora del intestino posterior sugieren que la microbiota del intestino posterior puede estar asociada con la DGL en vacas.