El viroid del mosaico latente del duraznero (PLMVd) es un patógeno importante que causa enfermedades en los duraznos. El control de este viroid sigue siendo problemático porque la mayoría de las variantes de PLMVd son asintomáticas, y aunque existen muchas pruebas de detección en uso, la fiabilidad de los métodos basados en PCR se ve comprometida por la compleja estructura secundaria de ARN ramificada del viroid y su diversidad genética. En este estudio, se desarrolló y validó un método de RT-qPCR en dúplex en comparación con dos RT-qPCR individuales previamente publicadas, que eran potencialmente capaces de detectar todas las variantes conocidas de PLMVd cuando se usaban en conjunto. Además, para simplificar la preparación de muestras, se compararon protocolos de extracción rápida basados en el uso de savia cruda o impresión de tejidos con kits de purificación de ARN disponibles comercialmente. El rendimiento del nuevo procedimiento se evaluó en un estudio de rendimiento de pruebas que involucró a cinco laboratorios participantes. Se demostró que el nuevo método, en combinación con enfoques de preparación rápida de muestras, es factible y fiable, con la ventaja de detectar todos los diferentes aislados/variantes de PLMVd ensayados en una sola reacción, reduciendo los costos para el diagnóstico rutinario.