La fosfatasa de azúcar fosfato de amplio espectro AtSgpp (NP_565895.1, locus AT2G38740) y la fosfatasa específica de DL-glicerol-3-fosfato AtGpp (NP_568858.1, locus AT5G57440) son miembros de la amplia familia de fosfatasas ácidas dependientes de magnesio de la subfamilia I con proteínas hidrolasas similares a haloácidos de dominio cap de tipo C1 (HAD). Aunque tanto AtSgpp como AtGpp tienen un sitio activo central superimponible tipo Rossmann, difieren con respecto al bucle-5 del dominio cap, lo que explica las diferencias en la especificidad del sustrato. Estudios funcionales recientes han demostrado el papel esencial pero no suficiente de la secuencia característica dentro del motivo-5 en la discriminación del sustrato. Para comprender mejor el mecanismo subyacente al control de la especificidad, exploramos determinantes de secuencia adicionales que sustentan la selección evolutiva divergente ejercida sobre la afinidad del sustrato de ambas enzimas. La diferencia más evidente se encontró en el bucle que precede al bucle-5 del dominio cap, que se extiende en tres residuos adicionales en AtSgpp. Para determinar si el acortamiento de este bucle restringiría la ambigüedad del sustrato de AtSgpp, eliminamos estos tres aminoácidos. Los análisis cinéticos de la proteína mutante resultante AtSgpp3 (F53, N54, N55) indican que la promiscuidad se ve comprometida. AtSgpp3 muestra el mayor nivel de discriminación para D-ribosa-5-fosfato en comparación con el resto de los metabolitos de éster fosfato probados, lo que puede sugerir una orientación adecuada de D-ribosa-5-fosfato en el sitio activo de AtSgpp3.