El objetivo de este estudio fue establecer un método denominado determinación simultánea para el contenido de cuatro ácidos grasos en semillas de Coix y proporcionar una referencia para el control de calidad de este tipo de ingrediente medicinal. Los contenidos de cuatro ácidos grasos en semillas de Coix se determinaron mediante cromatografía de gases, y el método fue posteriormente validado. Los rangos lineales del ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico y ácido linoleico fueron 282.50-2825.00, 262.00-1572.00, 425.20-2976.75 y 304.50-1218.00 ug/mL, respectivamente. Los valores de RSD de precisión, repetibilidad y estabilidad fueron inferiores al 3.00% (n = 6), con recuperaciones del 98.82-102.05% (RSD 2.22-4.60%, n = 6). Los contenidos de ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico y ácido linoleico en los 24 lotes de semillas de Coix fueron 0.11-0.32%, 0.06-0.08%, 0.35-1.17% y 0.31-0.73%, respectivamente. El ácido oleico tuvo el contenido más alto, seguido por el ácido linoleico, el ácido palmítico y el ácido esteárico. El método de detección establecido en este experimento se implementó de manera rápida y precisa, fue reproducible y pudo determinar simultáneamente los contenidos de cuatro ácidos grasos en semillas de Coix. Este estudio proporciona una referencia para evaluar la calidad de las semillas de Coix obtenidas de diferentes hábitats.