Un protocolo de una sola solución ha sido ampliamente utilizado para la determinación fluorimétrica de HO en aguas naturales por su decoloración del escopoletina fluorescente en presencia de la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). En este protocolo, la reacción entre la escopoletina y HO en la muestra y las adiciones internas subsiguientes, y las mediciones de la fluorescencia se llevan a cabo todas a un solo pH en una celda fluorométrica. Se ha encontrado que este protocolo es propenso a cuatro fuentes posibles de error. La variabilidad en la estequiometría de la reacción entre la escopoletina y HO en presencia de cantidades variables de exceso de escopoletina, el efecto del pH en la velocidad de reacción entre la escopoletina y HO, la fotodecoloración de la escopoletina y la desactivación de HRP. Estas posibles fuentes de error pueden ser evitadas en un protocolo de dos etapas en el cual la reacción entre HO y escopoletina se lleva a cabo inmediatamente después del muestreo a un pH de 7, y la medición de la fluorescencia se realiza más tarde a un pH de 9. Debería ser el protocolo de elección. Además, en el protocolo de dos etapas, después de la reacción inicial entre HO y escopoletina, la muestra puede ser almacenada a temperatura ambiente durante seis días y a 4 grados Celsius durante al menos un mes antes de medir su fluorescencia. Esta opción puede reducir significativamente la logística en el campo.