El estrés hídrico causado por la sequía afecta la productividad del cultivo de caña de azúcar. Una alternativa de cría es la selección de cultivares de caña de azúcar tolerantes a la sequía. El objetivo de este estudio fue la selección in vitro de cultivares tolerantes al estrés hídrico utilizando polietilenglicol (PEG) como agente estresante. Los cultivares (cv) Mex 69-290, CP 72-2086, Mex 79-431 y MOTZMex 92-207 fueron sometidos a diferentes concentraciones de PEG 6000 (0, 3, 6 y 9%) utilizando medio de cultivo semisólido de Murashige y Skoog. A los 30 días de cultivo, se evaluaron diferentes variables de desarrollo y los contenidos de materia seca (DM), proteína total (TP), prolina (Pr) y glicina-betaína (GB). Los resultados mostraron un desarrollo reducido en los cv CP 72-2086, Mex 79-431 y MOTZMex 92-207 con el aumento de la concentración de PEG. El cv Mex 69-290 mostró tolerancia al estrés osmótico de -0,45 MPa utilizando 3% de PEG. En general, el contenido de TP disminuyó con el aumento de la concentración de PEG, mientras que los contenidos de DM, Pr y GB aumentaron con la concentración creciente de PEG en todos los cultivares evaluados. Nuestros resultados sugieren que el cv Mex 69-290 tiene una ligera tolerancia al estrés hídrico y podría ser utilizado para el cultivo de secano con poca lluvia o riego reducido para una mejor eficiencia en el uso del agua. En conclusión, la técnica de selección in vitro de cultivares tolerantes al estrés hídrico inducido por PEG es una alternativa para la determinación temprana del estrés por sequía en la caña de azúcar.