Las anomalías cromosómicas sexuales son una causa bien establecida de fracaso reproductivo en caballos domésticos. Debido a su difícil diagnóstico, el programa de cría de Pura Raza Español estableció un cribado rutinario para anomalías cromosómicas en todos los caballos antes de inscribirlos en el libro de registro. Este procedimiento genómico combina una evaluación inicial basada en los resultados de las pruebas de paternidad de Repeticiones Cortas en Tándem (STR), seguida de un análisis confirmatorio de aberraciones en el número de copias (CNA) basado en Polimorfismos de Nucleótido Único (SNP) en casos positivos. Utilizando esta metodología, identificamos cinco nuevos individuos portadores de una aberración en el número cromosómico 65,XXY entre 27,330 potros inscritos en las últimas dos temporadas reproductivas. Los animales fueron inicialmente señalados como candidatos a CNA debido a resultados anormales en las pruebas STR. El análisis genotípico posterior utilizando un panel dedicado de STR ligado al sexo y un array de SNP de densidad media en ECAX y ECAY confirmó el diagnóstico como portadores de 65,XXY. Cuatro casos (con disponibilidad de muestras) se sometieron a un análisis adicional utilizando hibridación fluorescente in situ con sondas ECAX y ECAY, mostrando resultados idénticos. El análisis fenotípico reveló un desarrollo gonadal anormal en uno de los casos, mostrando que los otros cuatro tenían una morfología reproductiva normal. Hasta donde sabemos, este representa el mayor número de caballos que exhiben la forma equina del síndrome de Klinefelter (65,XXY) reportado hasta la fecha. Nuestro estudio destaca la importancia del cribado genómico en la detección precisa de anomalías cromosómicas en caballos.