La coccidiosis aviar, causada por spp., representa una carga económica importante para la industria avícola global, sin embargo, el diagnóstico preciso de infecciones mixtas sigue siendo un desafío. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un ensayo de PCR en tiempo real TaqMan-MGB cuádruple, altamente sensible y específico, para la detección simultánea de cuatro especies clave: , , , y . El ensayo demuestra alta sensibilidad y especificidad, con un límite de detección tan bajo como 10 a 10 copias de ADN/L. La validación con 165 muestras clínicas sospechosas de Fujian, China (2022-2024) reveló una tasa de infección del 93.3%, superior a la PCR convencional (89.7%). (78.8%) y (62.4%) fueron las más comunes, con infecciones mixtas en el 83.3% de los casos (dual, triple o cuádruple de especies). Este ensayo ofrece una herramienta eficiente para el diagnóstico clínico temprano, encuestas epidemiológicas a gran escala y estrategias de control dirigidas para la coccidiosis en la producción avícola.