La esterilidad masculina citoplasmática (CMS) es una característica importante para lograr la heterosis en el desarrollo de cultivos híbridos. Las mitocondrias contribuyen a la CMS, especialmente a través de reordenamientos del ADN mitocondrial (mtDNA) y genes quiméricos. Sin embargo, los mecanismos de la CMS no han sido completamente elucidados, y las líneas aloplásmicas isonucleares utilizadas en estudios previos tienen una utilidad limitada en la investigación de la CMS en algodón. En este estudio, se analizaron tres líneas de CMS (J4A-1, J4A-2 y J4A-3) y su línea mantenedora isoplásmica (J4B) en busca de diferencias estructurales en el mtDNA mediante secuenciación de alto rendimiento. Los resultados mostraron que el mtDNA estaba conservado (con similitudes superiores al 99%) entre las tres líneas de CMS y su línea mantenedora isoplásmica. Todas las líneas albergaban 36 genes codificadores de proteínas conocidos, 3 ARNr y 15 ARNt. Los genes codificadores de proteínas con mutaciones no sinónimas principalmente codificaban dos tipos de proteínas: ATPasa y proteínas ribosomales. Cuatro nuevos marcos de lectura abiertos (ORFs) (, , y ) fueron identificados como ORFs candidatos responsables de la CMS. Dos de los ORFs ( y ) fueron identificados como y de la línea de CMS de algodón de tierras altas 2074A (una línea con citoplasma CMS-D2-2 de Brandegee), respectivamente. Estos hallazgos proporcionan una referencia para la investigación de la CMS en algodón u otros cultivos.