A lo largo de la vida humana, desde la concepción hasta el final de la vida, las pequeñas moléculas tienen una relación intrínseca con numerosos procesos fisiológicos. La investigación sobre los objetivos de las pequeñas moléculas tiene importantes implicaciones para el descubrimiento farmacológico. La determinación de los sitios de acción de las pequeñas moléculas proporciona claridad sobre los mecanismos farmacodinámicos y toxicológicos de los fármacos de pequeñas moléculas, ayudando a esclarecer los efectos fuera del objetivo de los medicamentos y los mecanismos de resistencia. En consecuencia, en los últimos años han proliferado métodos innovadores para estudiar los objetivos de las pequeñas moléculas, destacándose la proteómica química como un desarrollo vanguardista en la biología química en la era post-genómica. La proteómica química puede identificar de manera no selectiva objetivos desconocidos de compuestos dentro de matrices biológicas complejas, con modalidades tanto de sonda como no de sonda que permiten una identificación efectiva de objetivos. Esta revisión intenta resumir métodos y ejemplos ilustrativos de identificación de objetivos de pequeñas moléculas a través de la proteómica química. Profundiza en las interacciones entre pequeñas moléculas y biología humana para proporcionar direcciones y estrategias fundamentales para el descubrimiento y la comprensión de nuevos fármacos, así como para mejorar la evaluación de la seguridad de los medicamentos.