La cereza terrestre de hojas cortadas (L.), una planta anual que contiene una variedad de ingredientes activos, tiene un gran valor medicinal. Sin embargo, los estudios sobre la diversidad genética y la estructura poblacional son limitados. En este estudio, desarrollamos marcadores de microsatélites de cloroplasto (cpSSR) y los aplicamos para evaluar la diversidad genética y la estructura poblacional. Se identificaron un total de 57 cpSSRs del genoma del cloroplasto. Entre todos los loci de cpSSR, los marcadores de mononucleótidos fueron los más abundantes (68.24%), seguidos por los de tetranucleótidos (12.28%), dinucleótidos (10.53%) y trinucleótidos (8.77%). En total, se seleccionaron 30 marcadores de cpSSR recién desarrollados con rico polimorfismo y buena estabilidad para análisis adicionales de diversidad genética y estructura poblacional. Estos cpSSRs amplificaron un total de 156 alelos, de los cuales 132 (84.62%) eran polimórficos. El porcentaje de alelos polimórficos y el valor promedio de contenido de información polimórfica (PIC) de los cpSSRs fueron del 81.29% y 0.830, respectivamente. El análisis de diversidad genética poblacional indicó que el número promedio observado de alelos, el número de alelos efectivos, la diversidad genética de Nei y los índices de información de Shannon de 16 poblaciones fueron 1.3161, 1.1754, 0.1023 y 0.1538, respectivamente. Además, el promedio aritmético no ponderado, el vecino más cercano, el análisis de coordenadas principales y los análisis de STRUCTURE indicaron que 203 individuos de 16 poblaciones se agruparon en cuatro clústeres. Un análisis de varianza molecular (AMOVA) ilustró la considerable variación genética entre poblaciones, mientras que el valor de flujo génico (0.2324) indicó un bajo nivel de flujo génico entre poblaciones. Nuestro estudio no solo proporcionó un lote de marcadores genéticos eficientes para la investigación, sino que también sentó una base importante para la protección y el mejoramiento genético de los recursos.