El kiwi (spp.) es un árbol frutal perenne, y la fruta del kiwi es económicamente y nutricionalmente importante a nivel mundial. Hasta la fecha, aproximadamente se han reportado 23 especies de virus de kiwi en todo el mundo. En cuanto al método de detección de virus de kiwi, informes anteriores utilizaron principalmente el método de detección de RT-PCR único. En la detección de virus de kiwi, la RT-PCR multiplex tiene la ventaja de ser rápida, confiable y económica. En este estudio, se estableció un método de RT-PCR multiplex estable, eficiente y confiable para la detección de los cinco virus de kiwi más comunes. Se optimizaron las concentraciones de Mg y HS-Taq y la temperatura de alineación en el sistema de PCR multiplex. Los resultados indican que la temperatura de alineación óptima fue de 56 grados Celsius; la concentración óptima de Mg añadido fue de 2 mM; y la concentración óptima de HS-Taq fue de 1,0 U/L. La estabilidad del sistema de RT-PCR multiplex optimizado se verificó mediante pruebas de muestras de campo, y los resultados mostraron que el sistema de RT-PCR multiplex era estable, eficiente y confiable. Esto proporcionará mucha comodidad para la detección de virus de kiwi en el futuro.