Las nanopartículas de targeting activo son una nueva generación de sistemas de entrega de fármacos y genes con el potencial de mejorar significativamente la entrega terapéutica en comparación con los enfoques convencionales de nanomedicina. A pesar de su potencial, la traducción de las nanopartículas de targeting activo enfrenta desafíos en la escalabilidad de la producción y la consistencia de lotes. Los métodos precisos de control de calidad para la carga terapéutica de nanopartículas y la caracterización del recubrimiento son críticos para lograr los niveles deseados de repetibilidad de lotes, eficiencia de carga de fármacos/genes, efectividad del recubrimiento de moléculas de targeting y perfiles de seguridad. Las limitaciones actuales en las tecnologías de caracterización de nanopartículas, como depender del análisis promedio de ensembles, plantean desafíos para evaluar el contenido de fármacos/genes y la heterogeneidad de la modificación de la superficie, lo cual puede afectar significativamente los resultados terapéuticos. Las tecnologías de análisis de molécula única han surgido como una alternativa prometedora, ofreciendo información detallada sobre la heterogeneidad y variaciones estocásticas entre lotes de nanopartículas. Esta revisión evalúa primero e identifica los desafíos de las herramientas tradicionales de caracterización de nanopartículas que dependen de métodos de cuantificación indirecta en solución a granel. Posteriormente, se presentan nuevas tecnologías de caracterización para la cuantificación de la carga terapéutica y la eficiencia del recubrimiento de la molécula objetivo con resolución de nanopartícula única, para ayudar a guiar a los investigadores hacia el avance de la traducción de las nanopartículas de targeting activo al entorno clínico.