El axolote atrae gran atención en todo el mundo por su importancia como modelo de investigación biomédica, pero alojar y mantener animales vivos es cada vez más costoso y arriesgado a medida que se desarrollan nuevas líneas transgénicas. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una vía práctica inicial para la criopreservación de esperma para apoyar el desarrollo de repositorios de germoplasma. El presente estudio ensambló una vía a través de la investigación de la recolección de esperma de axolote mediante stripping, almacenamiento refrigerado en varias presiones osmóticas, criopreservación en varios crioprotectores y fertilización in vitro utilizando esperma descongelado. Mediante el stripping de machos, se recolectaron de 25 a 800 uL de fluido seminal a concentraciones de 1.6 x 10 a 8.9 x 10 espermatozoides/mL. El esperma permaneció motil durante 5 días en la Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS) a osmolalidades de 100-600 mOsm/kg. El esperma criopreservado en pajillas francesas de 0.25 mL a 20 grados C/min en una concentración final de 5% DMFA más 200 mM de trehalosa y descongelado a 25 grados C durante 15 s resultó en un 52 +/- 12% de motilidad total post-descongelación. En seis ensayos de fertilización in vitro, el 20% de los óvulos probados con esperma descongelado continuaron desarrollándose hasta la etapa 7-8 después de 24 h, y un tercio de esos embriones (58) eclosionaron. Este trabajo es el primer informe de producción exitosa de crías de axolote con esperma criopreservado, proporcionando un marco general para el desarrollo de vías para establecer repositorios de germoplasma para futuras investigaciones y aplicaciones.