Una línea de segmento de cromosoma sustituido (CSSL) representa un recurso ideal para estudiar rasgos cuantitativos como la termotolerancia. Para desarrollar CSSLs intervarietal de trigo con E6015-3S (un genotipo sensible al calor) como padre receptor, se necesitan con urgencia marcadores de ADN únicos en todo el genoma para la selección asistida por marcadores. En este estudio, se diseñaron con éxito 11,016 pares de cebadores dirigidos a 5036 sitios de indel para E6015-3S, con una densidad promedio de 0.36 indels por Mbp. Se cree que estos pares de cebadores son únicos y polimórficos en el genoma del trigo; como se desprende de la evidencia, (i) el 76.18 al 99.34% de los 11,016 pares de cebadores arrojaron un solo hit durante el alineamiento de secuencias con 18 genomas secuenciados, (ii) el 83.59 al 90.98% de los 1042 pares de cebadores sintetizados amplificaron una sola banda en 16 accesiones de trigo, y (iii) el 59.69 al 99.81% de los 1042 pares de cebadores probados fueron polimórficos entre E6015-3S y 15 accesiones individuales de trigo. Se espera que estos pares de cebadores también tengan una excelente resolución en geles de agarosa o poliacrilamida, ya que la mayoría de ellos tienen tamaños de indel de 15 a 46 pb, tamaños de amplicón de 141 a 250 pb y ratios de polimorfismo de 6.0 a 25.0%. En conjunto, estos pares de cebadores son marcadores de ADN ideales para el desarrollo de CSSLs intervarietal y para aplicaciones más amplias, como la clasificación de germoplasma, pruebas de pureza de semillas, mapeo de ligamiento genético y mejoramiento asistido por marcadores en trigo, debido a sus características de unicidad, polimorfismo y facilidad de uso.