Entre los virus que infectan las cucurbitáceas, el virus del mosaico del melón (WMV) y el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) (Potyvirus: Potyviridae) son responsables de síntomas severos en cultivos de pepino, melón, sandía y calabacín en todo el mundo. En este estudio, se desarrollaron y validaron ensayos de PCR en tiempo real de transcripción inversa (RT-PCR en tiempo real) y PCR digital por gotículas (RT-ddPCR) dirigidos a los genes de la proteína de la cápside (CP) de WMV y ZYMV de acuerdo con los estándares internacionales de diagnóstico de plagas de plantas (EPPO PM 7/98 (5)). Primero, se evaluó el rendimiento diagnóstico de las RT-PCR en tiempo real de WMV-CP y ZYMV-CP, y los ensayos mostraron una sensibilidad analítica de 10 y 10, respectivamente. Las pruebas también mostraron una repetibilidad, reproducibilidad y especificidad analítica óptimas, y fueron confiables para la detección del virus en muestras infectadas naturalmente y en una amplia gama de hospedadores de cucurbitáceas. Basado en estos resultados, las reacciones de RT-PCR en tiempo real se adaptaron para establecer ensayos de RT-ddPCR. Estos fueron los primeros ensayos de RT-ddPCR destinados a la detección y cuantificación de WMV y ZYMV y mostraron una alta sensibilidad, siendo capaces de detectar hasta 9 y 8 copias/uL de WMV o ZYMV, respectivamente. Los RT-ddPCR permitieron la estimación directa de las concentraciones del virus y abrieron un amplio rango de aplicaciones en el manejo de enfermedades, como la evaluación de la resistencia parcial en procesos de mejoramiento, la identificación de eventos antagónicos/sinérgicos y estudios sobre la implementación de compuestos naturales en las estrategias de manejo integrado.