El maíz tradicional posee bajas concentraciones de provitamina A y vitamina E, lo que genera diversas preocupaciones de salud. Se han explorado alelos mutantes que mejoran el beta-caroteno (provitamina A) y el alfa-tocoferol (vitamina E), respectivamente, en los granos de maíz en varios programas de biofortificación. Para la mejora genética de estos nutrientes objetivo, se utilizan rutinariamente ensayos de PCR uniplex en la selección asistida por marcadores. Sin embargo, debido a las temporadas de cría consecutivas, el tiempo requerido para genotipar individualmente cada gen objetivo en grandes poblaciones de retrocruzamiento se convierte en una limitación para avanzar en las generaciones. Además, múltiples ensayos de PCR para varios genes aumentan los costos y recursos requeridos. Aquí, nuestro objetivo fue desarrollar un ensayo de PCR multiplex para identificar simultáneamente diferentes formas alélicas de los genes y validarlos en una población segregante basada en retrocruzamiento. El ensayo de PCR se llevó a cabo utilizando cebadores recién desarrollados para y un cebador específico para el gen . El ensayo de PCR uniplex se estandarizó para pares de cebadores seleccionados en la población BCF que segregaba para los genes y . Posteriormente, se desarrolló un ensayo de PCR multiplex para los genes y que se utilizó para el genotipado en la población BCF. El ensayo diferenciaba entre cuatro posibles clases genotípicas, a saber, , , , y . Este nuevo ensayo de PCR multiplex ahorró un 41.7% de los costos y un 35.6% del tiempo en comparación con dos ensayos de PCR uniplex individuales. El ensayo desarrollado podría acelerar los programas de mejoramiento de la calidad nutricional del maíz a través de un genotipado rápido y rentable para los genes objetivo. Este es el primer informe de un ensayo de PCR multiplex específico para los genes y para su uso en la mejora asistida por genómica en maíz.