La hierba raigrás perenne (L.), una especie importante de pasto forrajero en regiones templadas, es mejorada genéticamente mediante cría de poblaciones. Aunque se valora por su amplia base genética, las variedades sintéticas resultantes solo explotan parcialmente la heterosis. La cría de híbridos ofrece oportunidades para fijar patrones heteróticos beneficiosos de manera más efectiva y, por lo tanto, aumentar el potencial de rendimiento. Un cuello de botella sospechado en la producción de híbridos de raigrás perenne es la mezcla genética del germoplasma existente, lo que dificulta la definición de grupos heteróticos. En este estudio, se caracterizaron poblaciones parentales seleccionadas de un programa de cría de híbridos basado en esterilidad masculina citoplasmática (CMS) diploide y tetraploide utilizando genotipado por secuenciación (GBS). Las poblaciones híbridas, derivadas de 26 combinaciones parentales del programa de cría tetraploide, se probaron para el rendimiento y se compararon con variedades sintéticas en cinco sitios durante cuatro temporadas de crecimiento. Los híbridos superaron significativamente a los sintéticos en un 4.15% en promedio para el rendimiento total de materia seca. Además, el GBS reveló la existencia de subpoblaciones dentro del germoplasma CMS tetraploide. Esta estructura de subpoblación representa el potencial no explotado que podría utilizarse para la heterosis y aumentar aún más los rendimientos de biomasa. Aquí mostramos que los híbridos CMS generan ganancias sustanciales de rendimiento en el raigrás perenne y proporcionan un método para mejorar aún más la cría de híbridos, utilizando GBS para seleccionar grupos heteróticos.