Los miembros de las superfamilias de quinasas dependientes de calcio (CDPK/CPK) y quinasas relacionadas con SNF (SnRK) se encuentran comúnmente en plantas y algunos protistas. Nuestro conocimiento sobre la especificidad de los clientes de los miembros de esta superfamilia es fragmentario. Dado que esta familia está representada por más de 30 miembros, la identificación de relaciones de clientes específicas de quinasas y superpuestas es crucial para nuestra comprensión de las sutilezas de esta gran familia de quinasas en relación con las vías de transducción de señales. En este trabajo, utilizamos el ensayo de cliente de quinasa (KiC), un ensayo de fosforilación in vitro basado en espectrometría de masas, para identificar y caracterizar posibles objetivos de CPK/SnRK en Arabidopsis. Se examinaron ocho CPK (1, 3, 6, 8, 17, 24, 28 y 32), cuatro SnRK (subclase 1 y 2), y PPCK1 y PPCK2 contra una biblioteca de péptidos sintéticos que contiene 2095 péptidos y 2661 sitios de fosforilación conocidos. Se identificaron un total de 625 sitios de fosforilación in vitro correspondientes a 203 proteínas no redundantes. La quinasa más promiscuo, CPK17, tenía 105 proteínas objetivo candidatas, muchas de las cuales ya habían sido descubiertas. El análisis de secuencia de los fosfopéptidos identificados reveló cuatro motivos: LxRxxS, RxxSxxR, RxxS y LxxxxS, que estaban significativamente enriquecidos entre los clientes de CPK/SnRK. Los resultados proporcionan información sobre las arquitecturas de redes de señalización específicas de CPK y SnRK, así como superpuestas, y recapitulan muchas relaciones in vivo conocidas, validando este enfoque a gran escala para descubrir objetivos de quinasas.