El desarrollo de ensayos de flujo lateral rápidos, sensibles y rentables es crucial para la detección de micotoxinas, idealmente a nivel de atención primaria. Este estudio presenta el diseño y la optimización de un ensayo de flujo lateral competitivo basado en nanopartículas de oro (AuNPs) para la detección de zearalenona en muestras de alimentos. Comenzando con la síntesis y funcionalización de nanopartículas de oro, se procede a comparar la inmovilización de anticuerpos utilizando estrategias de conjugación química y adsorción física, optimizando parámetros como el pH, la concentración de anticuerpos y las condiciones de bloqueo para mejorar la estabilidad de los bioconjugados preparados. Los bioconjugados se caracterizan utilizando espectroscopia de absorción UV-visible y dispersión de luz dinámica para monitorear cambios en los espectros y el tamaño hidrodinámico de las AuNPs tras la adición de anticuerpos. La evaluación de estos bioconjugados se basa en su capacidad para unirse y manifestar un color, desarrollado debido a la unión de nanopartículas con la zona de prueba en la tira con el conjugado de toxina-proteína. Las tiras del ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral (LFIA) se preparan dispensando una línea de control (IgG) y una línea de prueba (conjugado de toxina-proteína) en una membrana de nitrocelulosa utilizando un dispensador de tiras de flujo lateral. La sensibilidad de las tiras LFIA se evalúa tras estandarizar las condiciones variando la concentración de zearalenona en las muestras spiked y optimizando la solución de tampón de corrida. El límite de detección y el límite de cuantificación bajo condiciones optimizadas se determinan en 0.7 ng/mL y 2.37 ng para muestras spiked de zearalenona. Además, la intensidad media de píxeles y los valores RGB se grafican en función de la concentración de zearalenona, que se puede utilizar en una aplicación colorimétrica basada en smartphone para la cuantificación de la cantidad de micotoxina en la muestra.