(1) Antecedentes: El carbono orgánico del suelo (COS) en suelos agrícolas juega un papel crucial en la mitigación del cambio climático global, pero también, y quizás más importante, en la fertilidad del suelo y, por lo tanto, en la seguridad alimentaria. Por lo tanto, es necesario entender la influencia de los sistemas de cultivo contrastantes en el COS no solo en la capa superficial del suelo, sino también en el subsuelo. (2) Métodos: En este estudio, analizamos el contenido de COS y los valores de C de un experimento de rotación de cultivos para la producción de biogás, establecido en el sur de Alemania en 2004. Comparamos dos rotaciones de cultivos, que diferían en sus proporciones de maíz (0 vs. 50%) y praderas de leguminosas perennes como cultivos principales (75 vs. 25%). El maíz se cultivó con trébol blanco sembrado. Ambas rotaciones tenían una variante sin fertilizar y una variante que fue fertilizada con digestato de biogás de acuerdo con la demanda de nutrientes de los cultivos. Dieciséis años después de establecer el experimento, se analizaron los efectos de la rotación de cultivos, la fertilización y la profundidad del suelo en el COS. Además, definimos un modelo simple de balance de carbono para estimar la dinámica de C en el suelo. Las simulaciones se compararon con datos de la capa superficial del suelo (0-30 cm) de 2009, 2017 y 2020, y con datos del subsuelo (30-60 cm) de 2020. (3) Resultados: La rotación de cultivos y la profundidad del suelo tuvieron efectos significativos, pero la fertilización no tuvo efecto en el contenido de COS y C. El COS difería significativamente entre las dos rotaciones de cultivos en cuanto a C en ambas profundidades, pero no en cuanto al contenido. El enriquecimiento anual en C (maíz) fue de 290, 34, 353 y 70 kg C ha por año de maíz en la capa superficial y en el subsuelo de los tratamientos sin fertilizar y fertilizados, respectivamente. Estas cantidades correspondieron a tasas de rotación de carbono de 0.8, 0.3, 0.9 y 0.5% por año de maíz. A pesar de que había un 50% de maíz en la rotación, el carbono del maíz solo representó el 20% de la captura de carbono observada en la capa superficial. Incluso con valores de parámetros predefinidos, el modelo simple de carbono reprodujo bien el C observado. La optimización de los parámetros del modelo disminuyó la eficiencia de uso del carbono del digestato en el suelo, así como la respuesta de la asignación de carbono subterráneo a la mayor productividad aérea del maíz. (4) Conclusiones: Dos hallazgos principales resultaron de esta combinación de medición y modelado: (i) la retención de carbono del digestato en el suelo fue baja y su efecto en C fue negligible, y (ii) las entradas de carbono del suelo provenientes del maíz solo respondieron ligeramente a la mayor productividad aérea. Concluimos que los stocks de COS en rotaciones de maíz para silo pueden ser preservados o mejorados si se incluyen praderas con cultivos perennes que compensen las relativamente bajas entradas de carbono del maíz.