Las células madre mesenquimales (MSC) juegan un papel importante en la medicina regenerativa y el descubrimiento de medicamentos debido a sus capacidades de diferenciación multipotencial y efectos inmunomoduladores. Comparadas con las culturas 2D tradicionales de MSC, las culturas 3D de MSC han surgido como un enfoque efectivo para mejorar la viabilidad, proliferación y funcionalidad celular, y proporcionar un entorno fisiológico más relevante. Aquí, revisamos el potencial terapéutico de las MSC cultivadas en 3D, destacando sus roles en la regeneración y reparación de tejidos y en el cribado de medicamentos. Además, resumimos casos exitosos que aplican MSC en 3D en la modelización de estados de enfermedad, permitiendo la identificación de nuevas estrategias terapéuticas. A pesar de estas aplicaciones prometedoras, discutimos los desafíos que aún persisten en la traducción clínica de las tecnologías de MSC en 3D, incluyendo la estabilidad, la heterogeneidad celular y los problemas regulatorios. Concluimos abordando estos obstáculos y enfatizando la necesidad de más investigación para explotar completamente el potencial de las MSC en 3D en la práctica clínica.