Los organoides intestinales poseen capacidad de autoorganización y recapitulan características esenciales de la arquitectura y función intestinal, lo que los convierte en modelos poderosos para investigar el desarrollo, los mecanismos de enfermedad, las pruebas farmacológicas y las interacciones huésped-microbio. Aunque se han establecido protocolos estandarizados para organoides intestinales de pollo, no ha estado disponible un sistema de cultivo definido para patos. En este estudio, optimizamos los procedimientos de aislamiento de criptas y la composición del medio de cultivo para establecer un sistema reproducible adaptado a las células madre intestinales de patos. Entre varias soluciones digestivas, el ácido etileno glicol tetraacético (EGTA) logró la mayor eficacia de aislamiento de criptas y supervivencia de organoides. La cultura en suspensión resultó en mejor supervivencia, proliferación y diferenciación de células madre intestinales que los métodos de interfaz aire-líquido y de embebido ( < 0.05). La inmunofluorescencia y la PCR en tiempo real indicaron la presencia de múltiples linajes epiteliales, incluyendo células madre, células de Paneth, enterocitos, células caliciformes y células enteroendocrinas. Los medios suplementados con CHIR99021 y LDN193189 (CL) apoyaron un crecimiento comparable al de los medios con EGF, Noggin y R-spondin 1 (ENR). El suero de patitos y factores específicos, como SB203580 y retinol, mejoraron aún más la formación de organoides y promovieron la diferenciación. Si bien el pasaje y la expansión a largo plazo siguen siendo técnicamente desafiantes, este trabajo proporciona el primer modelo de organoides intestinales de pato y sienta las bases para futuras aplicaciones en la investigación intestinal aviar, incluyendo nutrición, modelado de enfermedades y estrategias de intervención.