La pulpa dental tiene funciones críticas en el desarrollo dental, así como un papel continuo en la promoción y mantenimiento de la vitalidad de los dientes. En particular, su capacidad regenerativa permite restaurar los tejidos dentales después de daños causados por lesiones traumáticas o caries. Los procedimientos endodónticos regenerativos buscan utilizar estos procesos para estimular la reparación de la pulpa dental de manera mínimamente invasiva y reducir la necesidad de procedimientos más invasivos como el tratamiento de conducto radicular. La pulpa dental es una fuente de células de pulpa dental (DPCs), que tiene una subpoblación de células madre de pulpa dental (DPSCs), que son atractivas para su uso en medicina regenerativa debido a su alta tasa de proliferación, capacidad para diferenciarse en múltiples tipos celulares y su vitalidad preservada después de la criopreservación. El desarrollo de terapias clínicas de próxima generación que maximicen el potencial de la pulpa dental se basa en evidencia empírica sólida que surge de experimentación in vitro. Aquí, describimos un método modificado para el aislamiento eficiente de DPCs humanas primarias de terceros molares sanos para su cultivo utilizando un método de crecimiento de explantes en frascos recubiertos de membrana basal, así como el uso de macrofotografía de alta resolución para ilustrar los métodos. Críticamente, se toman medidas para minimizar el potencial trauma físico y mecánico a las células y maximizar el rendimiento. Las DPCs humanas cultivadas con este método pueden ser ampliadas en frascos de cultivo celular para facilitar su uso en varios procedimientos experimentales in vitro.