En este informe, describimos metodologías para el aislamiento y cultivo de células basales traqueales primarias de macacos rhesus, su criopreservación, almacenamiento a largo plazo y diferenciación. Estas son comparables a protocolos de vanguardia que se han desarrollado para células basales de las vías respiratorias de ratones y humanos. Este método se basa en el uso de medios patentados, proporcionando un protocolo fácilmente reproducible y aplicable para su uso en entornos de nivel de bioseguridad 2 (BSL2). Las tráqueas de macacos rhesus fueron aisladas después de la eutanasia de los animales y sometidas a digestión enzimática durante la noche. Las células de la capa epitelial fueron raspadas de la tráquea para el cultivo celular. Veinticuatro horas después de la siembra, las células basales se habían adherido y las células no adherentes fueron eliminadas. Las primeras pasadas de células basales pueden ser congeladas para su almacenamiento en nitrógeno líquido en pasajes tempranos o propagadas y diferenciadas en una interfaz aire-líquido y en un ensayo de tráquea esférica hasta el pasaje siete. Este protocolo proporciona una plataforma para el análisis de células basales de un pariente evolutivo cercano a los humanos.