El estado vulnerable del manatí amazónico indica la necesidad de buscar medidas para garantizar su conservación. En este contexto, el cultivo de células in vitro es una estrategia que debería al menos garantizar la preservación de su material genético. Así, establecimos por primera vez un cultivo primario de fibroblastos de manatí amazónico (TINsf) a partir de una biopsia de piel de un joven macho. El análisis cariotípico de los 3 degrees, 7 degrees y 12 degrees pasajes confirmó la identidad taxonómica de la especie (2n = 56/NF = 92) e indicó que este cultivo presenta estabilidad genómica. La expresión génica y proteica de la vimentina en el 13 degrees pasaje muestra la presencia predominante de fibroblastos en TINsf. Para probar la capacidad de respuesta de la línea celular a materiales y demostrar una posible aplicación de este cultivo, se expuso a aceite de semilla de andiroba (ASO), y se evaluaron su viabilidad y capacidad proliferativa. El ASO demostró efectos tóxicos en las concentraciones más altas y los tiempos de exposición más largos probados, reproduciendo resultados observados en cultivos humanos, lo que indica la aplicabilidad de TINsf en estudios toxicológicos y biotecnológicos. Después de la criopreservación, la línea TINsf mantuvo su potencial proliferativo, indicando el establecimiento de un nuevo cultivo disponible para futuros estudios.