El algodón de upland (L.) es un cultivo de mercancía global importante cuya producción está amenazada por el nematodo reniforme (Linford y Oliveira), una plaga parasitaria de plantas que causa pérdidas sustanciales en el rendimiento. La resistencia de la planta huésped ofrece una estrategia de manejo sostenible, pero los cultivares de algodón resistentes actualmente disponibles solo proporcionan protección parcial y a menudo requieren métodos de control suplementarios. En este estudio, se utilizó la edición genética de Repeticiones Palindrómicas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR)-asociadas a 9 (Cas9) para generar knockout dirigidos de () en algodón y evaluar su papel en la resistencia a . Se desarrollaron cuatro líneas de knockout independientes (A1, D3, E1 y P3), confirmadas por secuenciación, y se evaluaron por su resistencia al nematodo en condiciones controladas de invernadero. La reproducción del nematodo se redujo significativamente en las líneas D3 y E1, con menos conteos de huevos y menos etapas de vida vermiforme en comparación con los genotipos de control, Coker 312 (WT), Delta Pearl y Jin668. Las líneas editadas también mostraron fenotipos característicos de muerte celular en mesófilo, sugiriendo posibles efectos pleiotrópicos asociados con la resistencia mediada por -. El análisis de secuencia confirmó múltiples mutaciones homocigotas y heterocigotas en alelos de ambos subgenomas A y D, con las líneas D3 y E1 mostrando los perfiles de resistencia más fuertes. Estos hallazgos demuestran que la edición genética es un enfoque prometedor para mejorar la resistencia en el algodón.