Los pacientes con cáncer colorrectal metastásico (mCRC) que portan la mutación BRAFV600E tienen una peor respuesta a la quimioterapia y un mal pronóstico. El inhibidor BRAFV600E, vemurafenib, ha mostrado una eficacia modesta como monoterapia en mCRC mutado por BRAF debido al desarrollo de resistencia. El objetivo de este estudio fue realizar un perfil proteómico comparativo del secretoma de células de cáncer de colon sensibles y resistentes a vemurafenib que portan la mutación BRAFV600E, con el fin de identificar características secretorias específicas potencialmente asociadas con cambios en el fenotipo de las células resistentes. Con este fin, empleamos dos enfoques proteómicos complementarios, incluyendo electroforesis en gel bidimensional acoplada con espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF y análisis cuantitativo LC-MS/MS sin etiquetado. Los resultados obtenidos señalaron una regulación aberrante de la replicación del ADN y el estrés del retículo endoplásmico como las principales características del secretoma asociadas con el fenotipo quimiorresistente. En consecuencia, se discutieron en más detalle dos proteínas implicadas en estos procesos, incluyendo RPA1 y HSPA5/GRP78, en el contexto de redes biológicas y su importancia como posibles objetivos del secretoma para una evaluación funcional y clínica posterior. Los patrones de expresión de RPA1 y HSPA5/GRP78 en tejidos tumorales de pacientes con cáncer de colon también se encontraron en análisis in silico adicionales asociados con el estado de mutación BRAFV600E, lo que abre la posibilidad de extrapolar nuestros hallazgos y su implicación clínica a otros tumores sólidos que portan la mutación BRAFV600E, como el melanoma.