El retinoblastoma (RB) es una malignidad intraocular primaria en la infancia. Las recaídas pueden desarrollarse y causar cánceres secundarios durante el desarrollo posterior. Este estudio se estableció para identificar las condiciones óptimas de cultivo celular para el crecimiento de células de RB y para optimizar el crecimiento tumoral en un modelo. Las líneas celulares de RB (Y79 y WERI-Rb1) fueron cultivadas bajo tres condiciones diferentes y se analizaron la apoptosis, la proliferación y el crecimiento celular, así como los perfiles de expresión de dos marcadores de transición epitelial-mesenquimal (EMT). Los perfiles de expresión génica de EMT no cambiaron generalmente, mientras que los niveles de apoptosis, la proliferación celular tumoral y el crecimiento fueron significativamente influenciados por diferentes condiciones de cultivo celular. Para optimizar el ensayo de la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) limitado en tiempo, investigamos dos puntos de tiempo diferentes de inoculación de células tumorales (día de desarrollo embrionario EDD8 y EDD10) así como tres concentraciones celulares diferentes. Mostramos que la inoculación en EDD8 condujo a una formación de tumor disminuida y a la viabilidad del pollo, mientras que diferentes concentraciones celulares no cambiaron el tamaño y peso de los tumores en desarrollo. Nuestros hallazgos demuestran que las condiciones del medio, así como el punto de inicio para la inoculación de CAM, influyen significativamente en el resultado experimental de investigaciones que utilizan líneas celulares de RB.