La generación asistida de animales mutantes mediante repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente (CRISPR)/asociadas a CRISPR (Cas) se ha convertido en el método de elección para la elucidación de la función génica en el desarrollo y la enfermedad debido a los plazos reducidos para la generación de un mutante deseado, la facilidad para producir materiales en comparación con otras metodologías (como las células madre embrionarias, ESCs) y la capacidad para dirigir simultáneamente múltiples genes en una sesión de inyección. Aquí describimos un protocolo paso a paso, desde la preparación de los materiales hasta la inyección y validación de una inyección citoplasmática, que se puede utilizar para generar mutantes CRISPR. Esto se puede lograr desde el inicio de la inyección hasta la finalización en 2-4 h con altas tasas de supervivencia y desarrollo de cigotos inyectados y ofrece ventajas significativas sobre la microinyección en pronúcleos y otras metodologías previamente descritas.