En los últimos años, inducir células madre pluripotentes a diferenciarse en células germinales primordiales (PGCs) funcionales in vitro se ha convertido en un método importante para obtener una gran cantidad de PGCs. Sin embargo, la inestabilidad y la baja eficiencia de inducción del sistema de inducción de PGCs in vitro restringen la aplicación de PGCs en la producción de animales transgénicos, la conservación de recursos de germoplasma y otros campos. En este estudio, establecimos con éxito un modelo de inducción en dos pasos de PGCs de pollo in vitro, que mejoró significativamente la eficiencia de formación de células similares a PGC (PGCLCs). Para mejorar aún más la eficiencia de formación de PGC in vitro, se obtuvieron 5025 genes expresados diferencialmente (DEGs) entre células madre embrionarias (ESCs) y PGCs a través de RNA-seq. El análisis de enriquecimiento de GO y KEGG reveló que vías de señalización como BMP4, Wnt y Notch se activaron significativamente durante la formación de PGC, similar a otras especies. Además, notamos que el cAMP se activó durante la formación de PGC, mientras que el MAPK fue suprimido. Basándonos en los resultados de nuestro análisis, encontramos que la eficiencia de formación de PGC mejoró significativamente después de activar Wnt e inhibir MAPK, y fue menor que después de activar cAMP. En resumen, en este estudio, establecimos con éxito un modelo de inducción en dos pasos de PGCs de pollo in vitro con alta eficiencia de formación de PGC, lo que sienta una base teórica para demostrar más a fondo el mecanismo regulador de los PGCs y realizar sus aplicaciones específicas.