El cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) sigue siendo la malignidad ginecológica más letal, y todavía existe una necesidad médica no satisfecha de profundizar en la investigación básica sobre sus orígenes y mecanismos de progresión. Los organoides derivados de pacientes de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC-PDO) son un modelo poderoso para estudiar la complejidad del cáncer de ovario, ya que mantienen, in vitro, el perfil mutacional y la arquitectura celular del tejido canceroso. Las modificaciones genéticas mediante transducción lentiviral permiten nuevas perspectivas sobre las vías de señalización y la identificación potencial de biomarcadores relacionados con la evolución de la resistencia a fármacos. Aquí proporcionamos un protocolo detallado y profundo para modificar con éxito la expresión génica de HGSOC-PDOs mediante transducción lentiviral. Como ejemplo, validamos nuestro protocolo y creamos un knockdown estable del oncogén MACC1 con una eficacia de >=72% en dos líneas de HGSOC-PDO, que se mantuvieron estables durante >3 meses en cultivo. Además, explicamos paso a paso la preparación de muestras para los procedimientos de validación a nivel de transcripción (qPCR) y proteínas (Western Blot). La disminución sostenida de genes específicos por transducción lentiviral permite el análisis de los cambios fenotípicos y morfológicos resultantes. Sirve como un valioso modelo in vitro para estudiar los mecanismos de la patogénesis del cáncer de ovario y permite la evaluación de enfoques terapéuticos.