La microscopía de reflexión interna total basada en prisma (pTIRF) es una de las técnicas más ampliamente utilizadas para el análisis de moléculas individuales de una amplia gama de muestras que incluyen biomoléculas, nanoestructuras y células, por nombrar algunas. Permite la excitación de moléculas/partículas/puntos cuánticos unidos a la superficie a través del campo evanescente de una región confinada del espacio, lo que es beneficioso no solo para la detección de moléculas individuales, sino también para el análisis de la dinámica de moléculas individuales y para la adquisición de datos cinéticos. Sin embargo, hasta el momento no existe un microscopio comercial disponible para su compra ni una guía detallada dedicada a la construcción de este microscopio. Hasta ahora, los microscopios pTIRF se construyen a medida con el uso de un microscopio invertido disponible comercialmente, lo que requiere un alto nivel de experiencia en la selección y manejo de partes de instrumentos sofisticados. Para abordar directamente esta brecha tecnológica, aquí describimos una guía paso a paso sobre cómo construir y caracterizar un microscopio pTIRF para la imagen de moléculas individuales in vitro, análisis de nanoestructuras y otras investigaciones en ciencias de la vida.