El conocimiento preciso de la polaridad intracelular, un parámetro fisiológico que implica mecanismos intracelulares complejos e interconectados, puede ser relevante en el estudio de enfermedades importantes como el cáncer o el Alzheimer. En esta nota técnica, ilustramos nuestro método preciso y recientemente desarrollado para obtener mapas de polaridad intracelular empleando potentes técnicas de microscopía de fluorescencia. Nuestro método se basa en la selección de sondas luminiscentes apropiadas, en las cuales varias propiedades de emisión varían con la polaridad del microambiente, específicamente cambios espectrales y tiempo de vida de la luminiscencia. Se realiza una calibración multilínea, correlacionando la polaridad vs. cambio espectral vs. tiempo de vida de la luminiscencia, para generar un espacio 3D potente y libre de errores para la interpolación fiable de los datos de microscopía. Posteriormente, se utiliza la microscopía de luminiscencia multidimensional para obtener imágenes simultáneas de cambio espectral y tiempo de vida de la luminiscencia, las cuales son interpoladas en el espacio de calibración 3D, resultando en mapas de polaridad precisos y cuantitativos.