La criopreservación de esperma y el biobanco están surgiendo como herramientas para apoyar la gestión genética de poblaciones pequeñas y amenazadas en programas de conservación de anfibios. Sin embargo, hay poca o ninguna evidencia que demuestre la madurez reproductiva y la viabilidad de la descendencia generada con esperma criopreservado, lo que podría limitar la integración generalizada de estas tecnologías. El propósito de este informe es demostrar que el esperma de anfibios puede ser criopreservado y descongelado para producir con éxito individuos de una generación F1 que pueden alcanzar la adultez y la madurez reproductiva, generando gametos viables y una generación F2. Se administraron hormonas exógenas específicas de la especie a adultos F0 y F1 para estimular la espermiación y la oviposición en la salamandra tigre del este, la rana gopher oscura y el sapo crestado de Puerto Rico. Las células espermáticas recolectadas de manera no letal de adultos F0 fueron criopreservadas, descongeladas y utilizadas para la fertilización in vitro (FIV) para producir descendencia F1. Se ha demostrado que los individuos de la generación F1 alcanzan la adultez, expresan gametos viables y producen descendencia a través de la cría facilitada o la FIV. La producción de generaciones F2 de anfibios que se muestra aquí demuestra que el esperma de anfibios recolectado de manera no letal puede ser almacenado y utilizado para generar animales reproductivamente viables de generaciones posteriores, manteniendo así linajes genéticos valiosos y diversidad en especies de anfibios amenazadas. El increíble valor que tiene la criopreservación de esperma para la gestión genética a largo plazo ayuda en la sostenibilidad de los esfuerzos de conservación tanto in situ como ex situ para este taxón.